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·PCR
 
 





植物硝酸還原酶(NR)活性檢測試劑盒
 產品貨號: PN5040
 產品名稱: 植物硝酸還原酶(NR)活性檢測試劑盒
 產品價格/規格: 50次 400元
 產品說明書: 暫無
 更新時間: 2020-04-06
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  • 植物硝酸還原酶(NR)活性檢測試劑盒

    Plant NR Assay Kit                  Ver.690871

    產品組成:

    組分貨號

    名稱

    規格

    貯存

    運輸

    PN5040-01

    試劑1-NR誘導劑(50×)

    10 ml

    4

    RT

    PN5040-02

    試劑2-NR提取緩沖液(2×)

    25 ml

    4

    RT

    PN5040-03

    試劑3-NR分析緩沖液

    25 ml

    4

    RT

    PN5040-04

    試劑4-NADH10×)

    1.2 ml

    -20

    RT

    PN5040-05

    試劑5-顯色液1

    15 ml

    4

    RT

    PN5040-06

    試劑6-顯色液2

    15 ml

    4

    RT

    PN5040-07

    試劑7-標準液(100×)

    1 ml

    -20

    RT

    DT0140P

    1M DTT

    1 ml

    -20

    RT

    產品簡介:

    硝酸還原酶(Nitrate Reductase,NR,EC1.7.1.3)廣泛存在于植物中,是植物硝態氮轉化為氨態氮的關鍵酶,它的活性高低直接影響到植物對土壤中硝態氮素的利用,影響作物的產量和品質。硝酸還原酶是一種誘導酶,通常在有 NO3-存在時,會誘導硝酸還原酶的活性。

    測定原理:NR催化硝酸鹽還原為亞硝酸鹽,NO3ˉ+NADH→ NO2ˉ +NAD++H2O;產生的亞硝酸鹽能夠在酸性條件下,與對–氨基苯磺酸α-萘胺定量生成紅色偶氮化合物; 生成的紅色偶氮化合物在 540 nm有最大吸收峰,可用分光光度法測定。

    按照每次提取使用1 ml提取緩沖液計算,該產品可以使用45-50次。

    貯存和效期:

      試劑盒常溫運輸;按照標簽溫度貯存;開封使用后有效期一年。

    自備材料:

    植物根莖、葉子等;剪刀;離心管;分光光度計;水浴鍋;離心機;1ml比色皿

    操作步驟:

    用前必讀:由于不同材料NR活性差距較大,首次實驗時建議取2-3個預期差異較大的樣本做預測定。

    準備30度水浴;分光光度計調節到540nm,開機預熱30分鐘。

     樣本處理:

    1. 樣品的誘導前處理:

    將NR誘導劑(50×)用蒸餾水稀釋50倍,如取49 ml蒸餾水加入1 ml 誘導劑。 將植物樣品浸泡于誘導劑中,浸泡2小時。

    注:如未經誘導,植物體內NR活性很低,預測定結果沒有活性(OD測定管OD對照管)則需要誘導處理。

     硝酸還原酶提取:

    2. 即用型NR提取緩沖液配制:

     

    一個反應配制體積 1 ml

    n個反應配制體積 n×1 ml

    試劑2-NR提取緩沖液(2×)

    0.5 ml

    n×0.5 ml

    1 M DTT100×

    10 μl

    n×10 μl

    滅菌水

    0.49 ml

    n×0.49 ml

    注:配制好的即用型NR提取緩沖液可以4℃短期保存一周;

    3. NR提取步驟

    取誘導后的樣品或新鮮植物組織,清洗干凈,擦干,液氮中研磨,1 cm2葉片(1分硬幣大小)或0.1g葉片粉末加入1 ml 即用型NR提取緩沖液,顛倒混勻, 12000rpm4離心 5分鐘,上清即為NR提取液,冰浴放置備用。

    注:NR提取液最好立即測定,不建議保存。

    、硝酸根還原步驟:

    4. 即用型標準液配制:

    取試劑7-標準液(100×)稀釋100倍,即取10 μl加990μl滅菌水中,混勻,即用型標準液濃度為0.1 μmol/ml(100 μM)。

    5. 即用型NADH配制:

       根據標簽所示加入超純水配制試劑4-NADH(10×),稀釋10倍,如取100 μl加900 μl滅菌水,混勻,冰浴備用。

    6. 參考下表設置檢測反應體系,按照順序在1.5ml離心管中依次加入試劑(單位μl):

    加入順序

     

    1#測定管

    2#對照管

    3#標準管

    4#空白管

    1

    NR提取液(樣本)

    100

    100

    -

    -

    2

    即用型標準液 0.1 μmol/ml(100 μM)

    -

    -

    100

    -

    3

    蒸餾水

    -

    125

    -

    125

    4

    試劑3-NR分析緩沖液

    375

    375

    375

    375

    5

    即用型NADH

    125

    -

    125

    -

    6

     

    30度水浴0.5小時

    7

    試劑5-顯色液1

    250

    250

    250

    250

    8

    試劑6-顯色液2

    250

    250

    250

    250

    9

     

    混勻,常溫顯色0.5 小時

    四、計算:

    7. 用蒸餾水調零分光光度計,取1ml加到比色皿中,分別測定各管在540nm的吸光值,記錄讀數。

    NR單位定義(Units):每小時每克鮮重樣品中催化產生1μmol NO2-的量為一個NR活力單位。

    NR活性(μmol/h/g FW)=(測定OD-對照OD)/(標準OD-空白OD)×標準品濃度(0.1 μmol/ml)×(取樣體積0.1 ml)/(樣品鮮重g×反應時間0.5 h)×樣品測定前稀釋倍數(如0.1g葉片用1ml提取緩沖液,即稀釋10倍)

    此公式整理為:NR活性(μmol/h/g FW=0.2/FW×(測定OD-對照OD/(標準OD-空白OD

    8. 計算舉例:

    0.1克植物鮮重材料使用1 ml提取緩沖液提取:稀釋倍數為10

    測定OD=0.159 對照OD=0.121 標準OD=0.16 空白OD=0.004

    NR 活性(μmol/h/g FW)=0.2/0.1×(0.159-0.121)/(0.16-0.004)=0.012


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