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Puromycin Solution 嘌呤霉素溶液
 產品貨號: SP7255S
 產品名稱: Puromycin Solution 嘌呤霉素溶液
 產品價格/規格: 1ml 200元/5×1ml 800元
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 更新時間: 2020-04-06
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  • 嘌呤霉素溶液(10mg/ml)

    Puromycin Solution10mg/ml

    產品包裝:

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    產品名稱

    產品包裝

    說明書

    SP7255S-01

    嘌呤霉素溶液(10mg/ml)

    1×ml

    1

    SP7255S-02

    嘌呤霉素溶液(10mg/ml)

    5×1ml

    1


    Formula: C22H29N7O5·2HCl

    MW: 544.43

    Appearance: clear solution

    產品簡介:

    Puromycin是來源于Streptomyces alboniger的一種氨基核苷類抗生素,中文名為嘌呤霉素,常用于篩選能夠表達pac基因(puror)的細胞。pac基因表達嘌呤霉素N-乙酰轉移酶(Puromycin N-acetyl-tranferase),如果該基因表達,就會對嘌呤霉素產生抗性,這一特性目前普遍應用于篩選表達pac基因的哺乳動物穩定細胞株。目前,很多商業化的慢病毒載體都攜帶pac基因(一般在質粒圖譜上標記為puror),可以利用嘌呤霉素的篩選,得到特定基因穩定表達的細胞株。嘌呤霉素也可以用來篩選表達pac基因的大腸桿菌菌株、酵母菌株等。Puromycin不僅能用于穩定細胞株的篩選,也用于穩定細胞株的維持。Puromycin的作用特點是快速作用于細胞,一般2天內可以殺死99%的不表達pac基因的細胞。

    本產品濃度為10mg/ml,過濾除菌,可以直接用于細胞培養。

    保存條件:

    -20℃保存,有效期12個月。避免反復凍融。

    使用方法:

    推薦工作濃度:

    推薦的作用于哺乳動物細胞的嘌呤霉素濃度一般為1-10μg/ml(表1),但最佳工作濃度需要通過劑量反應曲線來確定。

    表1.  部分常見哺乳動物細胞的推薦工作濃度表

    細胞名稱

    細胞類型

    嘌呤霉素濃度

    A549

    Lung cancer

    1-2μg/ml

    B16

    Mouse melanocytes

    1-2μg/ml

    ES cell

    Human embryonic stem cells

    0.5-5μg/ml

    H1299

    Non-small cell lung carcinoma

    1-3μg/ml

    HEK293

    Human embryonic kidney

    0.5-3μg/ml

    HeLa

    Human cervical cancer

    1-2μg/ml

    HepG2

    Human hepatocellular carcinoma

    0.5-2μg/ml

    HT1080

    Human fibrosarcoma

    0.5-2μg/ml

    MCF-7

    Human breast cancer

    0.5-2μg/ml

    MDA-MB-231

    Human breast cancer

    0.5-5μg/ml

    MEF

    Mouse fibroblasts

    1-5μg/ml

    嘌呤霉素劑量反應曲線的確定(shRNA轉染或者慢病毒感染為例):

    嘌呤霉素的有效篩選濃度與細胞類型、生長狀態、細胞密度、細胞代謝及細胞所處細胞周期等因素相關。為了篩選到穩定表達的shRNA或感染病毒的細胞株,確定殺死未轉染/感染細胞的最低濃度嘌呤霉素非常重要。對于初次使用的細胞,一般需要通過實驗來確定適合自身實驗體系的劑量反應曲線(dose-response curve or kill curve)。

    1.  第一天:24孔板中以5~8×104cells/孔的密度接種細胞,接種夠量的孔以便進行后續的劑量梯度實驗。細胞培養箱內培養過夜。

    2.  第二天: 在培養過夜后的細胞中更換新鮮配制的篩選培養基,該篩選培養基為含不同濃度嘌呤霉素的新鮮培養基(如0、 1、2.5、5、7.5、10 μg/ml等),更換培養基后在細胞培養箱中繼續培養。

    3.  第三天后:由于嘌呤霉素可以快速作用于細胞,一般2天內可以殺死99%的未表達pac基因的細胞,所以在加嘌呤霉素后的1-2天就可以進行觀察細胞存活率,從而確定有效殺死正常細胞的藥物最低濃度。如果細胞耐藥性比較強,需要每日觀察,一般4-10天內即可確定嘌呤霉素的最低濃度。

    哺乳動物穩定表達細胞株的篩選:

    轉染含有pac基因的質粒或者感染含有該基因的病毒后,即可篩選穩定表達株。

    1. 細胞轉染或感染48小時后,將細胞置于含有適當濃度嘌呤霉素的新鮮培養基中培養,此為處理組。 注意:當細胞處于分裂活躍期時,抗生素作用最明顯。細胞過于密集,抗生素產生的效力會明顯下降,所以細胞的密度最好不超過25%。建議同時做一個正常細胞的對照組。轉染或感染48小時后,如果細胞過密也可以消化后重新接種細胞,培養過夜后即可進行嘌呤霉素篩選。

    2. 每隔2-3天,更換含有嘌呤霉素的培養基。

    3. 篩選7天后,對照組正常細胞應該100%死亡,處理組中存活的細胞為表達pac基因的細胞。然后根據實驗目的進行多克隆或單克隆細胞的篩選。

    注意:每日進行細胞生長狀態的觀察。嘌呤霉素的篩選至少需要24小時,有效濃度嘌呤霉素的篩選周期一般在2-10天。

    4. 待細胞可以穩定生長后,嘌呤霉素的濃度可以減半用于后續的培養。在得到穩定表達細胞株后,一般建議嘌呤霉素也須持續加入,并2-3天更換含有嘌呤霉素的新鮮培養液。


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