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分光光度計 260/280 260/230 比值所代表意義
發表日期:2020/4/21 來源:中科瑞泰(北京)生物科技有限公司   訪問次數:

分光光度計 260/280 260/230 比值所代表意義

核酸在波長 260 nm 處有最高吸收峰。 吸收紫外光的性質是嘌呤環和嘧啶環的共軛雙鍵系統所具有的,所以嘌呤和嘧啶以及一切含有它們的物質,不論是核苷、核苷酸或核酸都有吸收紫外光的特性。但紫外法不能區分 DNA RNA,只能用來鑒定核酸的純度和含量。 蛋白質由于含有芳香氨基酸,因此也能吸收紫外光。通常蛋白質的吸收高峰在 280nm 波長處,在 260nm 處的吸收值為核酸的十分之一或更低,故核酸樣品中蛋白質含量較低時對核酸的紫外測定影響不大。 RNA 的 260nm 與 280nm 吸收的比值在 2.0 以上;DNA 的 260nm 與 280nm 吸收的比值則在 1.9 左右。當樣品中蛋白質含量較高時260/280的比值即下降。如何避免吸光值漂移讀數不穩定可能是實驗者最頭痛的問題。靈敏度越高的儀器, 表現出的吸光值漂移越大。事實上, 分光光度計的設計原理和工作原理,允許吸光值在一定范圍內變化,即儀器有一定的準確度和精確度。

1.核酸本身物化性質:溶解核酸的緩沖液的 pH 值、離子濃度等在測試時,離子濃度太高也會導致讀數漂移,因此建議使用 pH 值一定、離子濃度較低的緩沖液(如 TE)可大大穩定讀數。 核酸的吸光值受 pH 值和緩沖液離子濃度影響。 只有在一定的 pH 值和低離子濃度的條件下(如 10 mM Tris-HCl pH 8.0 ),才能得到精確的檢測結果。水的 pH 值不穩定,可能導致檢測誤差。一些緩沖液在紫外范圍內存在自身吸收,為了確保準確測量,請使用與懸浮或洗脫樣品時相同的緩沖液。

2.樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素,由于樣品中不可避免存在一些細小的顆粒,尤其是核酸樣品。這些小顆粒的存在干擾測試效果。為了最大程度減少顆粒對測試結果的影響,要求核酸吸光值至少大于 0.1A  ,吸光值最好在 0.1-1.5 A 。在此范圍內,顆粒的干擾相對較小,結果穩定。從而意味著樣品的濃度不能過低,或者過高(超過光度計的測試范圍)。

3.操作因素:如混合要充分,否則吸光值太低, 甚至出現負值;混合液不能存在氣泡,空白液無懸浮物,否則讀數漂移劇烈;必須使用相同的比色杯測試空白液和樣品, 否則濃度差異太大; 換算系數和樣品濃度單位選擇一致;不能采用窗口磨損的比色杯;樣品的體積必須達到比色杯要求的最小體積等多個操作事項。

各波長具體含義及相關問題

1. A260nm 是核酸最高吸收峰的吸收波長,最佳測量值的范圍為 0.1 1.0。如果不在此范圍,稀釋或濃縮樣品,使之在此范圍內;如果吸光度小于 0.05 ,檢查是否存在操作因素(如移液不準確,樣品內有懸浮物等)影響。DNA 樣品的 A260  吸光度值是否 >0.1。(請注意,這個值跟儀器無關,核酸的吸光度必需大于 0.1,其值才有效和可靠,因為樣品中的雜質和顆粒這些不純物的干擾通常會對光有一定吸收,其值 <0.1 );

2. A280nm是蛋白最高吸收峰的吸收波長, A260/A280比值可進行核酸樣品純度評估: 純 DNA 的 A260/A280 比值為 1.8, 純 RNA為 2.0。如果比值低,表示受到蛋白(芳香族)或酚類物質的污染,需要純化樣品。

3. A230nm 是碳水化合物最高吸收峰的吸收波長,比值可進行核酸樣品純度評估:純 DNA 和 RNA 的A260/A230 比值為 2.5。若比值小于 2.0 標明樣品被碳水化合物(糖類)、鹽類或有機溶劑污染,需要純化樣品。 A230 產生負值主要是由于在很低 DNA  濃度的溶液中的一些其他成分的干擾所導致的。 在下一個測定中,需要降低樣品的稀釋度, A230 的負值會被校正。

4. A320nm A340nm 為檢測溶液樣品的濁度和其他干擾因子。 該值應該接近 0.0。如果不是,說明溶液中有懸浮物, 需要純化樣品。純樣品的 A320 一般是 0

5. A260/A280 A260/A230 是核酸純度的指示值。純度好的 DNA 或 RNA,在 pH7-8.5  下 A260 / A280 的比值應該在 2.0  或 2.5。純凈的樣品A260 / A280比值大于 1.8(DNA)或者 2.0(RNA )。如果比值低于 1.8  或者 2.0,表示存在 蛋白質 或者酚類物質的影響。 A230 表示樣品中存在一些污染物,如碳水化合物、鹽(胍鹽)等,較純凈的核酸 A260/A230的比值大于 2.0  。當 260/230<1 時,只有兩種情況。一是胍鹽污染,二是蛋白污染。當 0.5BSA 蛋白質污染時,蛋白污染會導致 260 280 的數值都下降,但 260/280 的比值變化并不顯著(即是說比值可能也在1.7-1.8)。但蛋白殘留會導致 230 的數值顯著上升,顯著降低 260/230 的比值。也就是說,如果 RNA 樣品的 260/280 1.7260 /230 0.5,那么就應該考慮污染原因不是胍鹽殘留,而是蛋白殘留 。

6. 其他:用分光光度計 測量核酸樣品 時,應該用有緩沖能力pH8.010mM Tris-HCl 溶解核酸樣品,不應該用水,用水稀釋核酸樣品會造成 A260/A280 比值下降。原因是低離子強度和低 pH 溶液會增加 280 nm 處的光吸收值。


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